1.紫外-可見光譜鑒別法 多數有機藥物分子中含有能吸收紫外可見光的基團,從而顯示特征吸收光譜,這是紫外-可見光譜鑒別法的依據。鑒別時一般采用對比法,按規定的方法配制供試品溶液與對照品溶液,通過對比吸收光譜的特征數據、吸收度或吸收系數、吸收光譜的一致性等進行鑒別。由于紫外-可見吸收光譜比較簡單,光譜的曲線形狀變化不大,專屬性不如紅外光譜,同一物質圖譜相同,但圖譜相同的卻不一定為同一物質。但由于紫外-可見分光光度法比較方便,所以制劑的鑒別一般不采用紅外分光光度法,而采用紫外-可見分光光度法。
紫外-可見分光光度法應用時,主要有以下幾種方式。
(1)規定波長處最大或最小吸收,一般是特征吸收波長位置(λmax或λmin)。
如鹽酸偽麻黃堿鑒別項下要求“取本品,加水制成每1mL中含0.5mg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在251nm、267nm與263nm的波長處有最大吸收”。
如芬布芬鑒別項下要求“取本品,加無水乙醇制成每1mL中約含5μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在281nm的波長處有最大吸收,在238nm的波長處有最小吸收”。
(2)測定一定濃度的供試液在最大吸收波長處的吸光度。
如棕櫚氯霉素鑒別項下要求“取本品,加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1mL中含20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在271nm波長處有最大吸收,其吸光度約為0.35”。
(3)吸收系數法:測定吸收波長,計算吸收系數。
如氫化可的松性狀項下要求“取本品,精密稱定,加無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1m.中約含10μg的溶液,照紫外-可見分光光度法,在242mm的波長處測定吸光度,吸收系數為422～448”。
(4)吸光度比值法:測定不同波長處的吸光度,比值在一定范圍內。可以是吸收峰與吸收峰的比值,也可以是吸收峰與吸收谷的比值。
如丙酸倍氯米松鑒別項下要求“取本品,精密稱定,加乙醇溶解并定量稀釋制成每1mL中約含20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在239nm的波長處有最大吸收,吸光度為0.57～0.60;在239nm與263nm的波長處的吸光度比值應為2.25～2.45”。
(5)樣品經化學處理后,測定反應生成物的吸收光譜特性。
以上方法可以單個應用,為了提高鑒別的專屬性,也可以幾種方法結合起來使用,如丙酸倍氯米松的鑒別。
2.紅外光譜鑒別法 紅外光譜鑒別法是一種專屬性很強、應用廣泛的方法,主要用于組分單一、結構明確的原料藥,特別是結構復雜、用其他常用方法不易區分的藥物,并且適用于固體、液體甚至是氣體的樣品鑒別。
應用紅外光譜進行鑒別試驗時,藥典采用標準圖譜對照法。在藥典規定的條件下測定供試品的圖譜,然后與國家藥典委員會編訂的《藥品紅外光譜集》對照。
《藥品紅外光譜集》分卷出版,分別為第一卷(1995年出版)、第二卷(2000年出版)、第三卷(2005年出版)、第四卷(2010年出版)。每次新版中收載的藥品紅外光譜圖包括新增品種和老品種重新繪制的圖譜。所以,如果同一化合物的圖譜在不同卷上均有收載時,用于鑒別時以后卷圖譜作為比對依據,前卷光譜圖僅作為參考。光譜圖中的橫坐標為波數(cm-1),縱坐標為透光率(T%)分辨率為2cm-1,基線一般控制在90%透光率以上,供試品取量一般控制在使其最強吸收峰在10%透光率以下。
原料藥的鑒別除另有規定外,應按照《藥品紅外光譜集》各卷收載的各光譜圖所規定方法制備樣品。常用的制備方法有壓片法、糊法、膜法、溶液法、衰減全反射法和氣體法等。
組成相對穩定的多組分原料藥鑒別不能采用全光譜比對,需參照原料藥的標準光譜,在指紋區內選擇主要成分的若干個特征譜帶作為鑒別的依據。
制劑鑒別應按品種鑒別項下規定的前處理方法處理,通常是采用溶劑提取法。提取時應選擇適宜的溶劑,盡可能減小輔料對鑒別結果的干擾,并且避免導致提取過程中藥物晶型的轉變。提取后的樣品經適當干燥后依法進行鑒別。
在比對光譜時應注意以下兒點。
(1)輔料無干擾,待測成分的晶型不變化時,可直接與原料藥的標準光譜進行比對。
(2)輔料無干擾,而待測成分的晶型有變化時,可用對照品經同法處理后的光譜比對。
(3)待測成分的晶型不變化,而輔料存在不同程度的干擾時,可參照原料藥的標準光譜,在指紋區內選擇3~5個不受輔料干擾的待測成分的特征譜帶作為鑒別的依據。鑒別時,實測譜帶的波數誤差應小于規定值的0.5%。
(4)待測成分的晶型有變化,輔料也存在干擾,此種情況一般不宜采用紅外光譜鑒別。
對照時一般先看最強峰的吸收位置、形狀、數目等是否一致,然后再檢查中等強度峰和弱吸收峰是否對應,如果供試品的紅外光吸收圖譜與對照品的圖譜完全一致,一般可認為是同一種化合物(只有少數例外,如有些光學異構體或大分子同系物等)。若兩光譜圖不同,則可判定兩化合物不同。但是在實際操作中由于繪制圖譜時受藥物粉末細度、吸水程度、試樣的處理和制備等多種外界條件的影響較大,圖譜易發生變異,因此在圖譜對照時,要充分考慮各種因素可能造成的影響。
藥典一般不單獨用本法進行鑒別,常與其他理化方法聯合進行鑒別。
如硫酸阿托品鑒別項下規定:①本品(試樣制備:KBr壓片法)的紅外光吸收圖譜應與對照的圖譜(《藥品紅外光譜集》一致;②本品顯托烷生物堿類的鑒別反應;③本品的水溶液顯硫酸鹽的鑒別反應。